如今NGS已能夠快速經(jīng)濟地閱讀數(shù)億個reads，所及之處遠超越基因組學(xué)（如RNA測序使轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)生革命性變化）。盡管NGS取得了諸多進步，但依然存在一些重大的挑戰(zhàn)。日前，牛津大學(xué)舉辦的“NGS七周年大會”聚焦了NGS面臨的挑戰(zhàn)，此次會議闡述了NGS領(lǐng)域最令人生畏的障礙，同時也闡述了跨越這些障礙的技術(shù)。
　　
　　本次會議中提及的NGS的新突破點包括毒性、RNA-Seq文庫及可變剪接圖譜中的多余轉(zhuǎn)錄組的去除以及線粒體DNA測序。如今NGS在線粒體DNA測序領(lǐng)域取得了一定的進展，線粒體在疾病發(fā)展中的作用逐漸被認識，然而這些細胞器中的DNA測序十分復(fù)雜，因為線粒體具有相當大的遺傳復(fù)雜性和異質(zhì)性。NGS的另一個突破點為腫瘤異質(zhì)性分析，長期以來腫瘤分析都被異質(zhì)性困擾著，但幸運的是，異質(zhì)性腫瘤樣本可通過排序程序?qū)⒉∽兗毎麖目側(cè)后w中分離出來，且這些細胞群更適合測序。
　　
　　消除毒性轉(zhuǎn)錄組（ToxicTranscripts）

　　
　　
　　InDA-C技術(shù)效應(yīng)圖
　　
　　創(chuàng)建高特性的RNA-Seq文庫仍面臨著長期的挑戰(zhàn)，NuGENTechnologies技術(shù)總監(jiān)LukeSherlin博士說，“減少不必要轉(zhuǎn)錄組如rRNA、球蛋白以及其他管家類的轉(zhuǎn)錄組，同時保持總RNA群中的必要轉(zhuǎn)錄組十分有必要。”NuGENTechnologies公司開發(fā)了新技術(shù)來實現(xiàn)這個目標，他們在RNA-Seq文庫構(gòu)建的過程中，利用InDA-C（Insert-DependentAdaptorCleavage）方法（使用特定的酶）來消除文庫中多余的轉(zhuǎn)錄組序列，這種方法與雜交捕獲方法形成對比。“InDA-C是一種靈活的方法，容易應(yīng)用于各種不同的物種如人類、小鼠、大鼠、果蠅和擬南芥等”，Sherlin說，“InDA-C技術(shù)是一種相對較新的方法，可提供一種獨特的方式來構(gòu)造任何物種的無偏差的RNA-Seq文庫，且定制步驟方便簡單。”
　　
　　可變剪接和RNA-Seq數(shù)據(jù)庫
　　
　　RNA-Seq技術(shù)還提供了一個寶貴的工具來破譯轉(zhuǎn)錄組的可變剪接。有些基因的一個mRNA前體通過不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點）產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體，這一過程稱為可變剪接(或選擇性剪接，alternativesplicing)。可變剪接是調(diào)節(jié)基因表達和產(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性的重要機制，是導(dǎo)致真核生物基因和蛋白質(zhì)數(shù)量較大差異的重要原因。
　　
　　霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳醫(yī)學(xué)研究所LilianaFlorea教授表示，“人類基因組計劃10年前創(chuàng)建了剪接變異初始圖譜，但該圖譜仍不完整，仍欠缺包含所有可變剪接的存儲庫。每個剪接變異體的編目帶來的挑戰(zhàn)是令人畏懼的，但RNA-Seq技術(shù)可深入分析細胞和組織的轉(zhuǎn)錄組，提供一種可詳細描述可變剪接的技術(shù)手段。但RNA-Seq仍然很難準確拼湊長異構(gòu)體所產(chǎn)生的小片段。
　　
　　Florea教授報告稱，她和她的同事們決定開發(fā)適用于RNA-Seq數(shù)據(jù)的計算機系統(tǒng)，“我們決定開發(fā)其他程序無法達到的算法來確定二次變異。”使用這種工具，她希望能夠明確可變剪接是如何發(fā)生以及如何隨細胞類型發(fā)生變化。該研究團隊曾利用Illumina公司的BodyMapdataset建立每個組織的可變剪接的綜合目錄，該目錄囊括了16個組織的25億個序列，被用于不同組織的比較。然而這種比較是一個艱巨的任務(wù)，為了保持比較的精度，研究人員依賴于內(nèi)部軟件套件SpliceBox，該研究小組發(fā)現(xiàn)，超過60%的發(fā)現(xiàn)是新的，包括新的外顯子、新的內(nèi)含子等。
　　
　　“這種方法可對現(xiàn)有的變異注釋數(shù)據(jù)庫進行補充，還可為可變剪輯的進化和發(fā)展提供新的見解”，F(xiàn)lorea教授強調(diào)，“但更多的RNA-Seq分析需要進一步評估，我們希望更多的實際應(yīng)用，包括臨床測序、基本分子生物學(xué)、癌癥研究、甚至包括植物基因組學(xué)。”
　　
　　線粒體DNA測序
　　

　　異質(zhì)性混合物從母親遺傳給后代
　　
　　線粒體，這些神奇的細胞體，不僅產(chǎn)生ATP供應(yīng)能量，還與人體罹患癌癥、心臟病和糖尿病的風(fēng)險有關(guān)。西奈山醫(yī)院腫瘤學(xué)教授RaviSachidanadam博士引領(lǐng)的研究證實了這些觀點。Sachidanadam教授表示，“真核細胞有兩個基因組——核DNA（nDNA）和線粒體DNA（mtDNA），雖然線粒體的活性取決于上千個蛋白質(zhì)，這些蛋白主要由核DNA編碼，但由線粒體DNA編碼的蛋白（大約13個以上）也扮演了關(guān)鍵的角色。”
　　
　　線粒體DNA測序不是一件小事，因為每個線粒體攜帶了多個線粒體基因組（5-10個），且每個細胞擁有成百上千的線粒體。Sachidanadam博士承認，準確編目線粒體DNA多樣性是一項挑戰(zhàn)，雖然線粒體DNA豐度不及總DNA的1%，但它在細胞之間多重復(fù)合，同時核DNA測序結(jié)果經(jīng)常被線粒體DNA混淆。
　　
　　為了克服這些挑戰(zhàn)，Sachidanadam博士及其同事開發(fā)了一種稱為MSeek的線粒體測序技術(shù)。Sachidanadam博士說，“將線粒體孤立起來相當苦難，我們的方法包括通過耗盡線性核DNA及廉價測序來凈化線粒體DNA，MSeek可產(chǎn)生高純度的線粒體DNA（>90%），所達的靈敏度和特異性前所未有，這個方法是凈化和檢測線粒體DNA的新方法。”
　　
　　該研究團隊所取的重大突破是確定了核酸外切酶V是消化核DNA的最佳酶，該酶同時可保持線粒體DNA圓形完好無損。Sachidanadam博士補充說，他們利用Illumina公司的Miseq測序平臺來展開這個試驗，并計算假基因的含量。
　　
　　使用MSeek技術(shù)，該研究團隊得到了一個驚人的發(fā)現(xiàn)，“我們不僅證實了異質(zhì)性無處不在（多個線粒體DNA單倍體的存在），我們還發(fā)現(xiàn)了異質(zhì)性可作為細胞類型的識別指紋，此外我們還發(fā)現(xiàn)細胞之間可互相交換線粒體DNA，這影響了單個細胞中線粒體DNA的穩(wěn)定性。”
　　
　　Sachidanadam博士說，“我們團隊現(xiàn)研究成果僅僅是MSeek技術(shù)所揭露的一小部分，雖然MSeek技術(shù)目前面臨的局限為所需的DNA總量至少為4ug，我們預(yù)計該技術(shù)將被應(yīng)用到其他領(lǐng)域中，不僅包括治療，還包括取證等。
　　
　　從FFPE中分離出純的腫瘤細胞
　　
　　根據(jù)SiliconBiosystems首席商務(wù)官RaimoTanzi博士，腫瘤分析通常因為異質(zhì)性而存在困擾，數(shù)字分析方法的引進，如NGS和數(shù)字PCR可助于梳理少數(shù)的腫瘤樣本，然而只有均質(zhì)抽樣才能提供最清晰的解釋。為了解決這些問題，SiliconBiosystems應(yīng)用了新的數(shù)碼技術(shù)（DEPArray™）從異構(gòu)的腫瘤樣本中分離出純細胞群，該半導(dǎo)體技術(shù)基于在CMOS芯片上利用雙向電泳（DEP）將單細胞與單級電泳結(jié)合。
　　
　　Tanzi博士說，“FFPE樣本最初先被轉(zhuǎn)化為細胞懸濁液，并被給予適當?shù)臉擞洠笾糜谝淮涡缘奈⒘骺睾兄校坏┨幱诹鲃蛹毎麪顟B(tài)，每個細胞先被CMOS芯片控制電極捕獲，然后被顯微鏡掃描并獲得熒光圖像。根據(jù)這些圖像，每個細胞被識別為特定的類型（腫瘤、基質(zhì)等），最終同種類型的細胞純度在100%。”
　　
　　新技術(shù)可將幾十到幾百個純細胞從細胞池中分離出來并用于全基因組分析。細胞池中可能包括上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞和間質(zhì)細胞。Tanzi博士說，“DEPArray是第一個自動化技術(shù)可從異構(gòu)的FFPE樣本中分離出純的細胞，這給許多研究帶來了好處，其中包括一些與癌癥相關(guān)的研究，如樣品的均勻性、明確識別拷貝變異數(shù)、雜合子丟失等。該技術(shù)的另一個可能用途是進行非常小的樣本的遺傳分析，包括細針穿刺標本和腫瘤低細胞結(jié)構(gòu)的遺傳分析。”顯然，研究人員在NGS領(lǐng)域取得了令人興奮的進展，未來應(yīng)該有更快、更精確、更新穎的技術(shù)。
　　
　　提高文庫制備的性能
　　
　　文庫制備是NGS的重要部分，成功的測序需要高質(zhì)量的文庫來產(chǎn)生足夠的收益。由于測序技術(shù)的提高以及范圍的擴大都受文庫建設(shè)的推動。高性能的分析是十分必要的，包括低輸入量以及低質(zhì)量樣本或包含極端CG含量樣本的分析。同時需要協(xié)議來保證文庫的質(zhì)量。新英格蘭生物實驗室研究人員表示他們最近重新研制了NEBNNextUltraDNA工作流程中的試劑配方，為Illumina創(chuàng)建NEBNextUltraIIDNA文庫制備試劑盒（NEBNextUltraIIDNALibraryPrepKit）。根據(jù)NEBNext開發(fā)組組長EileenDimalanta博士，新的試劑能使客戶克服了文庫制備面臨的挑戰(zhàn)，如復(fù)雜的樣品類型，F(xiàn)FPEDNA、樣本中CG含量的統(tǒng)一以及PCR循環(huán)數(shù)等。