液相色譜柱進展及其在藥品標準中的應用（一）

——液相色譜柱及其填料種類

　　高效液相色譜法(HPLC)已成為藥物分析，特別是多組分分析和雜質控制中最重要、最廣泛的分析技術之一。伴隨著理論體系不斷完善，分離方法不斷更新，儀器性能不斷改進，應用領域不斷擴展，液相色譜分析技術已經、正在和必將繼續飛速發展。就技術領域發展而言，主要包括儀器性能、數據處理以及色譜柱技術等方面的提高和改進。如今，色譜柱技術的不斷改進創新，填料種類的日益豐富，分離模式和分離方法的逐步完善，為分離分析科學描繪了一幅幅絢麗的圖景。由于色譜柱是液相色譜分離的核心，開發新型或高性能的高效液相色譜填料(又稱為填充劑、固定相)，提供多種色譜柱類型一直是色譜研究中最豐富、最有活力、最富于創造性的內容。本文將主要討論液相色譜柱及其填料的進展分類，以及在藥品標準、特別是在藥典中的應用現狀。

　　1　液相色譜柱及其填料種類

　　改善分離度和色譜峰形一直是分析工作者關注的主要問題，通過改變流動相組成來提高色譜柱的選擇性是分析工作中常用的手段。不過，由于改變流動相如有機相比例、pH、緩沖鹽濃度等以提高色譜柱的選擇性或分離能力有限，為適應日益增加的分離要求，開發選擇性更高、性能更優越的色譜柱就成為液相色譜法的研究熱點之一。如今，為適應分離工作數量和難度的需求，越來越多的色譜固定相被開發出來，并不斷地被應用于實際分析包括藥物分析工作中。色譜柱填料的基質、形狀、尺寸、類型、直徑、孔徑、比表面積等因素將影響色譜柱的性能。為便于理解，下文按不同的方式對色譜柱或填料進行分類。

　　1.1　按色譜填料種類不同分類

　　按基質材料化學組成的不同，液相色譜填料主要分為兩大類：有機基質填料和無機基質填料。無機基質填料是研究和應用的主流，其中應用最多的材料是硅膠，其具有機械強度高，比表面積大及表面易于修飾等特點，是開發最早，研究最為深入，應用最為廣泛的液相色譜填料，其應用占液相色譜填料的90%以上。硅膠表面覆蓋著強極性的硅醇基，在非極性流動相中與樣品分子發生作用，也可以作為化學鍵合相的反應位點。因此，硅膠、鍵合硅膠是正反相液相色譜法中最常用的色譜柱填充劑。

　　最初使用的硅膠填料是無定形微粒硅膠，無定形硅膠易于制備，價格低廉，但渦流擴散大，滲透性差，柱效不高，重現性較差。20世紀70年代，科克蘭(J. J. Kirkland)采用硅珠堆砌技術制備全多孔球形ZORBAX 硅膠，該填料平均粒徑約7微米，具有更好的滲透性、比表面積和更高的柱效，而且球形填料易于填裝，重現性好。到1995年，在分析色譜中不定型填料基本被5-10微米的球形顆粒填料取代，前者因為價格便宜，主要是用于制備色譜分離;現在的分析色譜中，球形顆粒硅膠基質的色譜填料已經占絕對地位。

　　硅膠基質分為A型硅膠和B型硅膠：A 型硅膠金屬含量較高，導致硅膠純度較低，且酸性較強，從而導致色譜峰拖尾和某些化合物回收率很差;B 型硅膠是通過全合成獲得的填料，稱之為高純硅膠，可有效地控制金屬離子的含量(一般控制在0.05%以內)，避免活性化合物在色譜柱上與金屬離子產生螯合，也降低了硅醇基的活性，有利于避免堿性化合物拖尾。另外，為了提高硅膠基質的穩定性，在硅膠表面進行有機改性，如聚合物包覆，或引入有機雜化基團，可以使基質填料表面的部分硅羥基被有機基團代替，從而提高pH 耐受性，也能降低堿性化合物的拖尾。

　　有機基質填料主要分為多糖型和聚合物型兩大類，前者是以天然多糖化合物為原料，用物理方法加工成微球并經過交聯而得到的凝膠，如葡聚糖、瓊脂糖等基質的凝膠，主要用于凝膠滲透色譜(GPC)。后者以合成單體與交聯劑為原料，用化學聚合方法制備的交聯高聚物微球，如苯乙烯- 二乙烯基苯共聚物以及聚甲基丙烯酸酯類樹脂等，有機聚合物填料排除了硅醇基的影響，具有較強的色譜容量，不容易產生不可逆的非特異性吸附，有較好的化學穩定。

　　1.2　按鍵合相種類不同分類

　　中國藥典(0512 高效液相色譜法)按鍵合相種類不同分類如下：

　　反相色譜柱：以鍵合非極性基團的載體為填充劑填充而成的色譜柱。常見的載體有硅膠、聚合物復合硅膠和聚合物等;常用的填充劑有十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、辛烷基硅烷鍵合硅膠(C8)和苯基鍵合硅膠等。

　　正相色譜柱：用硅膠填充劑或鍵合極性基團的硅膠填充而成的色譜柱。常見的填充劑有硅膠、氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠等，在使用正相體系時，一般都采用弱極性的溶劑作為流動相。此類極性固定相如硅膠、氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠等也可使用含水的流動相，此時化合物的保留隨著流動相中水的比例增加而減弱，這種分離模式稱為親水作用液相色譜(hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC)。

　　離子交換色譜柱：用離子交換填充劑填充而成的色譜柱。有陽離子交換色譜柱和陰離子交換色譜柱。

　　手性拆分色譜柱：用手性填充劑填充而成的色譜柱。

　　在中國藥典分類所述的各類色譜柱中，反相色譜柱是應用最廣泛、最常見的一種。

　　1.3　按色譜柱填料粒徑大小分類

　　根據色譜填料粒徑的大小，色譜柱可分為常規色譜柱、亞2 微米填料色譜柱和大粒徑色譜柱。常規的色譜柱內徑一般為3.9~4.6 mm，填充劑粒徑為3~10微米。限于儀器系統、載樣量、柱效、分離度等因素的影響，5微米粒徑，4.6 mm×250 mm 尺寸的色譜柱依然是常規液相分析中最廣泛的色譜柱尺寸。但在常規液相體系中使用3微米或3.5微米的填料時，可在獲得較快分析速度的同時，節省溶劑，故又稱溶劑節省柱。

　　亞2微米填料色譜柱通常填充1.3~2.0微米 的顆粒填料，色譜柱內徑一般為2.1~3.0 mm，長度一般為30~150 mm。由于這樣的色譜柱填料粒徑小，在液相系統中會產生極高的反壓，壓力通常大于40 MPa，故需要在更高的超高壓(或超高效)液相色譜系統中使用。

　　大粒徑色譜柱(粒徑大于10微米)現主要用于制備色譜分離純化，即制備色譜柱;或者用于大分子物質分析如凝膠滲透色譜或體積排阻色譜(GPC/SEC)。用于大分子物質，如聚合物、蛋白、單抗等分析時，一般相對分子質量都大于2000，采用的色譜填料孔徑應大于300 。

　　1.4　按色譜柱填料結構類型分類

　　在色譜分離過程中，溶質分子與固定相間的傳質速率通常被其在色譜柱填料中的擴散所左右。顆粒形狀和大小，孔的結構、孔徑及其分布等與比表面積有關。按照色譜填料孔結構類型主要有無孔型、全多孔型和表面多孔型。

　　無孔型的填料表面無孔，消除了溶質在孔內較慢地擴散傳質引起的譜帶展寬效應，可提高柱效，但由于其比表面積非常小，載樣量也很小，故應用不多。一般使用非常細的填料(1~1.5 微米)，填充于較長的色譜管柱中，用于大分子物質分析。

　　全多孔型填料是在硅膠制備過程中形成的多孔硅膠，多孔體系的形成有利于提高溶質在固定相中的分配和保留，具有柱容量大和選擇范圍寬等優點。全多孔型填料又分為顆粒型(particles)和整體化色譜柱(monolithic column)，其中全多孔型填料顆粒(total porous particles)是目前使用最多的液相色譜固定相材料。

　　表面多孔型填料是在無孔實心的硅膠核外面生成一個均勻的多孔外殼。由于顆粒內核是實心的，溶質成分在通過固定相時，只在顆粒填料表面的多孔成分進行吸附和分配，其擴散路徑縮短，傳質效率提高，只需要花費少量的時間便能擴散至硅球表面的顆粒孔中，在較短時間完成擴散，更快地傳質。與相同粒徑的全多孔型填料相比，其傳質速度和柱效得到大大提高。全多孔顆粒填料和核殼型填料的顆粒構造如圖1所示。

　　注：近年來，液相色譜柱技術發展的非常迅速，這同時也促進了高效液相色譜法在藥物分析中更為廣泛的應用。據統計，一個典型的制藥企業甚至可能會擁有成百上千支液相色譜柱，在一種藥物分析方法的開發過程中，如何選擇適當的色譜柱往往會給實驗人員帶來很多困擾。

　　本文獻原文刊登于《藥物分析雜志》2017年37卷第2期，作者為洪小栩、石瑩、宋雪潔等八人，分別來自國家藥典委員會、揚子江藥業、安捷倫科技和江蘇省食品藥品監督檢驗研究院等單位。本文為該文獻的第一部分，詳細介紹了液相色譜柱及其填料的種類。儀器信息網后續還將發布該論文其余內容，為廣大色譜柱用戶以及色譜柱供應商提供相關參考。