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生化分析儀常用分析方法

作者: 2013年07月17日 來源: 瀏覽量:
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生化分析儀常用分析方法共有三大類,分別為終點法、固定時間法和動力學法。終點法:指經(jīng)過一段時間的反應(yīng),反應(yīng)達到平衡,由于反應(yīng)的平衡常數(shù)很大,可認為全部底物(被測物)轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物,反應(yīng)液的吸光度不再變化,只

      生化分析儀常用分析方法共有三大類,分別為終點法、固定時間法和動力學法。

     終點法: 指經(jīng)過一段時間的反應(yīng),反應(yīng)達到平衡,由于反應(yīng)的平衡常數(shù)很大,可認為全部底物(被測物)轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物,反應(yīng)液的吸光度不再變化,只與被測物的濃度有關(guān)。這類方法通常稱為“終點”法,更確切地說應(yīng)稱“平衡”法。

單試劑單波長終點法:t1時刻加入試劑(體積為V),t2刻加入樣本

(體積為S),然后攪拌并反應(yīng),之后開始測量反應(yīng)液的吸光度,

在t3時刻反應(yīng)達到終點,t3-t2為測定時間。

    反應(yīng)度R=At3-At2-1×V/(V+S),或R=At3-ARBLK。

    其中: Ati為i時刻的吸光度,ARBLK為試劑空白吸光度。

單試劑雙波長終點法: 基本上同“單試劑單波長終點法”,只是對于每一個測定周期,其實際吸光度等于Aλ1-Aλ2。

雙試劑單波長終點法:t1時刻加入第一試劑(體積為V1),t2時刻加入                                      樣本(體積為S)之后立即攪拌,t3時刻加入第二試劑(體積為V2)                                               并立即攪拌,t4時刻反應(yīng)達到終點。t3-t2為孵育時間,t4-t3為測定時間。

 

在項目參數(shù)中,如果反應(yīng)起始時間設(shè)為0,則反應(yīng)度R=A時刻吸光度-雙試劑空白吸光度。    如果反應(yīng)起始時間小于0,則反應(yīng)度R=At4 -雙試劑空白吸光度-t3到t2間設(shè)定點的吸光度×(V1+S)/(V1+S+V2)。

雙試劑雙波長終點法: 基本上同“雙試劑單波長終點法”,只是對于每一個測定周期,其實際吸光度等于Aλ1-Aλ2。

固定時間法:又稱為一級動力學法、二點動力學法等,指在一定的反應(yīng)時間內(nèi),反應(yīng)速度與底物濃度的一次方成正比,即v=k[S]。由于底物在不斷的消耗,因此整個反應(yīng)速度在不斷的減小,表現(xiàn)為吸光度的變化越來越小。這類反應(yīng)達到平衡的時間很長,理論上可以在任意時間段進行監(jiān)測,但由于血清成份復雜,反應(yīng)剛啟動時反應(yīng)較復雜,雜反應(yīng)較多,必需經(jīng)過一段延遲時間才能進入穩(wěn)定反應(yīng)期。

t1時刻加入試劑(體積為V),之后測量試劑空白的吸光度,t2時刻加入樣本(體積為S),t3時刻反應(yīng)穩(wěn)定,t4時刻停止對反應(yīng)進行監(jiān)測;t2-t3為延遲時間,t3-t4為測定時間。

單波長反應(yīng)度(單雙試劑相同):R=At4—At3

雙波長反應(yīng)度:R=(t4時刻主波長吸光度-t4時刻次波長吸光度)--(t3時刻主波長吸光度-t3時刻次波長吸光度)

動力學法:又稱零級動力學法,指反應(yīng)速度與底物濃度的零次方成正比,也就是與底物濃度無關(guān)。因此,在整個反應(yīng)過程中,反應(yīng)物可以勻速地生成某個產(chǎn)物,導致被測定溶液在某一波長下吸光度均勻地減小或增加,減小或增加的速度(ΔA/min)與被測物的活性或濃度成正比。動力學法也被稱為連續(xù)監(jiān)測法;主要用于酶活性的測定。

    實際上,由于底物濃度不可能足夠大,隨著反應(yīng)的進行,底物消耗到一定程度后,反應(yīng)速度不再為零級,因此,零級動力學法是針對于特定時間段而言的;同樣,由于血清成份復雜,反應(yīng)剛啟動時反應(yīng)較復雜,雜反應(yīng)較多,必需經(jīng)過一段延遲時間才能進入穩(wěn)定反應(yīng)期,各試劑商對這兩段時間有嚴格規(guī)定。

t1時刻加入試劑(體積為V),t2時刻加入樣本(體積為S),t3時刻反應(yīng)穩(wěn)定,tn時刻停止對反應(yīng)進行監(jiān)測;t3-t2為延遲時間,tn-t3為測定時間。 單波長反應(yīng)度(單雙試劑相同)R=(n∑AT-∑A∑T)/[n∑T2-(∑T)2],其中:n=t3到tn間的數(shù)據(jù)個數(shù) ,T=時間 , A=某一時間的吸光度。雙波長反應(yīng)度基本同單波長,只是某一時間的吸光度等于主波長吸光度減去次波長吸光度。

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