【概述】

全世界都在使用農藥來提高作物產量，農藥的使用對保證足夠的全球食物供應至關重要。然而，對于消費者以及致力于食品安全保障的政府部門來說，如此廣泛的農藥使用及其在最終產品中殘留的可能性，都是心頭之患。

因此，法律法規保障消費者不會接觸到受農藥污染的食物。這些法律法規要求對食物中出現的農藥進行種類和數量的監測，并針對具體商品種類給出每種農藥允許的最大殘留值（MRL）。由于化合物和商品種類組合的數量巨大，給實現準確可靠的常規監測帶來很大挑戰。

實驗室一直在面對不斷增長的分析壓力，必須以高速度和有競爭力的成本在單次樣本分析中實現廣譜農藥篩查。絕大多數實驗室都會借助氣相色譜或液相色譜與質譜聯用儀器以及定靶分析的策略。這類方法的確能夠在較大范圍內覆蓋需監測的化合物種類并達到所需靈敏度和選擇性。然而，它們只局限于目標列表中的化合物，這些化合物通常是根據殘留量規定和法律法規的要求來選擇的，主要是為了證明被檢測的食物樣本適合食用。這些定靶分析技術通常需要事先仔細地為每種化合物優化采集參數以及采集時間窗口以確保有效檢測。為了擴展分析的視野，近年來使用高分辨全掃質譜法的化合物篩查方法開始受到青睞。

這些篩查方法使用非定靶的分析策略，先運行一個普通的全掃采集，然后再根據所用的數據庫進行定靶數據處理。雖然數據分析也是根據目標化合物列表進行的，不過即便并未在數據采集時專門篩查這些未知化合物，仍然可以在數據回溯分析中對未知化合物進行分析。

為使這一方法適用于常規分析，數據篩查處理軟件必須足夠快足夠準，以便達到歐盟指令描述的要求1，在可接受的低假陰性率水平下實現低濃度農殘的檢出。雖然對假陽性率沒有具體要求，不過常規實驗室還是需要保證這個數字盡可能的低，以盡量減少進一步分析所需的時間。實驗室檢測的絕大部分樣品都是符合法律法規要求的，因此能夠快速的區分開符合要求的樣品和可能受到污染的樣品對實現高效非常重要。在初步的篩查之后，可能的陽性樣品會使用另一套確證方法（例如，GC-MS/MS）進行再分析，以確認是否是陽性結果，并準確測定農殘的濃度。確證分析涉及在合適的基質中制備標準曲線等步驟，并不包含在本文描述的篩查方法當中。

【實驗/設備條件】

Q Exactive GC 系統在 EI 全掃模式下運行，分辨率為 60,000（FWHM，m/z 200）。此外，還以 15K、30K 和 120 K 等不同分辨率進行了其它實驗。色譜數據采集確保不少于每峰 11 個點，以保證峰面積積分的準確性。

【樣品提取】

樣品前處理

首先用乙酸緩沖液和基于QuEChERS方法的提取程序處理食物和飼料樣品。簡短來說，將10 mL酸化的（1%乙酸）乙腈加入5g（早餐麥片或飼料）或10 g（水果蔬菜等）均質化的樣品中。加入混合鹽類，震蕩并離心。向最終提取液（0.5或1 g/mL樣品的乙腈溶液）中加入55種農藥的混合物，濃度范圍為0.5–100 ng/g（ppb）。我們分析了多種難度較大的基質樣品，包括小麥、韭蔥，以及馬飼料。

【實驗/操作方法】

在本研究中，我們評估了Thermo Scienti?cTM Q Exactive TM GC 組合四極桿-Orbitrap 質譜儀（MS）在準確篩查適合 GC 分析的農藥時的表現。Q Exactive GC Orbitrap MS 能夠提供的質量分辨率高達 120，000（m/z 200，峰高一半處的全峰寬，FWHM），因而能夠實現高準確度的質量測定，從而有效地在復雜基質中將被分析物與共流出的等質量數干擾物等雜質分離開。高掃速和單次目標分析物掃描內的高動態范圍（> 5000）也都有助于從復雜基質中檢出痕量化合物。

【實驗結果/結論】

本研究的目標是以最高置信度在不同樣品基質中大范圍篩查多種農藥。分析以篩查樣品中農藥殘留是否超過MRL水平（通常為10 ppb）為目的。評估方式是通過對不同加標濃度的強化小麥（forti?ed wheat）、馬飼料、以及韭蔥提取液進行篩查，測定所述條件下所加標樣的最低檢出濃度。我們選擇這些基質樣品是由于它們在農殘分析中以復雜和具有挑戰性而著稱，圖1所示總離子流譜圖也證明了這點。

常規農殘分析使用的樣品提取方法非常普通（例如QuEChERS），得到的提取液非常復雜多變。由于樣品前處理階段缺乏選擇性，必須在儀器分析過程中進行彌補。提高選擇性的方式可以是使用高質量分辨率和高質量精度進行分析。隨著樣品復雜度的增加，質譜儀的分辨能力對于可靠的農殘檢測十分關鍵。分辨能力的重要性在適合LC的農殘分析中已有體現2。此外，高分辨全掃分析無需優化數據采集參數即可擴大分析的視野的特性也十分誘人。

樣品通量

樣品通量是農殘分析當中需要考慮的一個重要因素。因此，我們使用了一個快速色譜方法來測試系統在常規條件下的表現。該色譜方法可以在17 min之內（兩次進樣之間）完成一次完整的分析，從而能夠在24小時之內完成84次分析。這雖然是一個快速的GC方法，質譜儀的高掃速仍然確保了每個色譜峰取到了至少11個點。圖2所示為峰寬為1.8秒的二嗪農色譜峰，可見共有11個數據點。

圖2.添加了 10 ng/mL 二嗪農（m/z 179.11789 ± 5 ppm 質量窗口）的小麥樣品分析的提取離子流圖（XIC），全峰包含 11 次掃描（峰寬 1.8 sec）。數據采集在全掃模式下進行，分辨能力為 60,000 FWHM（m/z 200）。如圖所示，每次掃描的質量準確度和質量差異（ppm）均非常理想，全峰的平均質量差異為 0.3 ppm。

在以60,000質量分辨率進行了全掃分析之后，使用TraceFinder軟件進行數據處理。樣品篩查使用一個包含了183種農藥的分子式、準確質量、保留時間、同位素峰分布（通過診斷離子的分子式推算）、以及碎片離子等信息的數據庫進行。雖然以上所有參數都可以用于鑒定，軟件使用的陽性檢出關鍵依據為：主要鑒定離子的提取離子流譜圖中在預期出峰時間±20秒窗口內必須有色譜峰，并且測得的離子準確質量必須在理論值±2ppm范圍內。同位素峰分布以及碎片離子的保留時間和準確質量。引入這些參數能夠提高分析結果的可信度并降低假陽性率。

篩查軟件

好的數據處理軟件是成功執行常規篩查的一個關鍵。TraceFinder軟件能夠迅速篩查數據并檢測是否存在目標農藥。我們使用了一個目標化合物數據庫來檢測和報告檢出的農藥，并注明滿足了哪些檢出標準。圖3給出了一個TraceFinder瀏覽窗口樣例，圖中顯示的是在添加了10 ng/mL標樣的小麥樣品中檢出的一些農藥。農藥p,p'-DDT的檢出和確認是基于保留時間、準確質量數（0.21 ppm）、碎片離子、以及同位素分布信息的吻合，在圖中以紅色標出。數據以交通信號燈的形式展示在用戶面前，便于快速審閱。更詳細的信息可以在總結欄和窗口欄目中查閱，如本樣例中的XIC以及p,p'-DDT的理論和實際同位素分布情況。即便是在復雜基質中，本系統也能夠提供無與倫比的準確質量數據，使得化合物檢出的可信度非常高。所有農藥篩查都在< 2 ppm的質量準確度下進行，而如圖3所示，實際的質量差異通常只有亞ppm水平。對主要的診斷離子和碎片離子來說，準確質量檢測都能達到這種水平，從而可以自動篩出假陽性結果或提示用戶快速評估。

圖3.添加了10 ng/mL標樣的小麥樣品中檢出的農藥（以p,p'-DDT為例）在TraceFinder篩查瀏覽器中顯示界面。農藥檢出的確認是基于準確質量確認（±2 ppm質量窗口）、保留時間（RT）、同位素峰分布（IP）、和碎片離子（FI）信息的吻合。紅色方框提示的是主要離子和確證離子檢測的亞ppm水平質量準確度。

低于MRL水平的篩查

在本研究中，當加標濃度為10 ng/mL時，所有55種農藥都在小麥、馬飼料、和韭蔥樣品中成功檢出。不僅如此，絕大多數農藥都可以在更低的濃度被檢出。如圖4和5所示，在小麥基質中，53種農藥均可在< 2.5 ng/mL濃度水平下檢出，而在加標水平降低至0.5 ng/mL時，仍有47種農藥可被檢出。這種在復雜基質中也可以達到的無可比擬的靈敏度能夠有效支持在MRL規定的濃度水平甚至更低水平實現可信篩查，這也成為Q Exactive GC系統的一個獨特特性。

圖4.小麥中55種農藥的最低檢出標樣濃度圖。鑒定基于準確質量差異< 2 ppm和保留時間差異不超過20秒。紅圈為5 ng/mL濃度水平。

圖5.馬飼料中55種農藥的最低檢出標樣濃度圖。鑒定基于準確質量差異< 2 ppm和保留時間差異不超過20秒。圖中強調了5 ng/mL和10 ng/mL濃度水平。

借助分辨能力避免假陰性結果

只有當分辨能力足以將目標化合物與基質干擾和其它目標化合物區分開來時，使用較低的質量準確度容忍度才成為可能。當兩個質量輪廓圖重合時，測得的質量輪廓實際是兩者之和，導致目標化合物的質量測定不準確。圖6顯示的正是這一現象。該實驗分別以15K、30K、60K和120K分辨率對韭蔥樣品進行了分析。質譜圖中可見一個氯苯胺靈的診斷離子，以及一個質量相近的背景基質離子對其造成干擾。在60K和120K分辨率下，分析可達到預期的質量準確度，實現基線分離。然而在15K和30K分辨率時，氯苯胺靈未能與干擾離子實現分離，降低了質量準確度。尤其是在15K分辨率下，質量準確度受到嚴重影響，質量差異高達18.4 ppm。按照本研究使用的篩查標準，即便將質量差異容忍度進一步放寬到10 ppm，仍然會造成氯苯胺靈的假陰性結果。這些試驗結果說明高于60,000的質量分辨能力是必須的，而這個最低分辨能力的具體值則取決于樣品的復雜度以及目標化合物和干擾物的濃度。

圖6.分辨能力會影響基質中被分析物的質量準確度。在15K、30K、60K和120K質量分辨率下采集的韭蔥提取液中，10 ng/mL氯苯胺靈的一個離子的質譜圖。15K和30K分辨率不足以分開氯苯胺靈離子與基質干擾峰，導致質量精確度變差。在15K分辨率時，按照本研究的篩查標準，該農藥會不能檢出，導致假陰性結果。

圖7.在TraceFinder軟件中查看韭蔥中丁苯嗎啉的提取離子流譜圖和校準曲線。校準樣品進行了三次平行重復進樣，線性良好。

農藥定量分析表現

在常規分析中，接下來應該對樣品中檢出的農藥進行定量分析。我們在0.5–50 ng/mL濃度范圍內，用基質匹配過的樣品評估了農藥檢測的線性，每個校準標品重復分析三次。在所有情況下，決定系數（R2）均> 0.99，平均值為R2= 0.997，回歸殘差< 25%。

圖7以丁苯嗎啉為例給出了化合物定量校準曲線。檢出化合物的完整定量流程不在本研究討論范圍內，不過在Thermo Scienti?c應用文獻104493中有詳細描述。

結論

本次評估的結果顯示， Thermo Scientific Q Exactive GC 組合四級桿-Orbitrap 質譜儀佐以 TraceFinder 軟件，對于食品和飼料的常規農殘篩查來說是一套極其有效的工具。Orbitrap 質譜儀的分辨能力、質量準確度和靈敏度都非常出色。

1. 使用高分辨全掃質譜分析進行篩查是擴大分析范圍的有效方法，憑借該技術，無需提前進行采集參數優化即可在單次實驗中分析更多的化合物。

2. 快速GC分析和采集速率提高了實驗室的分析效率和樣品通量。超群的質量精確度再加上極高的靈敏度，使得可靠的常規農殘篩查成為可能。

3. 以 60,000 FWHM （m/z 200）的質量分辨率進行數據采集能夠消除同質量化合物的干擾，提高在復雜基質中篩查農藥的結果可信度。對所有化合物都持續提供亞 ppm 水平的質量精度，確保化合物鑒定結果可信。

【儀器/耗材清單】

全部分析均使用Thermo Scienti?cTM Q Exactive TM GC組合四極桿-Orbitrap質譜儀進行。進樣使用的Scienti?cTM Q TriPlusTM RSH自動進樣器，色譜分離使用Thermo Scienti?cTMTRACETM 1310 GC，色譜柱為Thermo Scienti?cTMTraceGOLDTMTG-5SilMS 15m×0.25 mm I.D.×0.25 µm薄膜毛細管柱（P/N：26096-1301）。

【參考文獻】

1.SANCO/12571/2013. Method validation and quality control procedures for pesticides residue analysis infood and feed.

2. Kellmann, M., Muenster, H., Zomer, P. & Mol,

H.(2009) Full Scan MS in Comprehensive Qualitativeand Quantitative Residue Analysis in Food and FeedMatrices: How Much Resolving Power is Required?J AmSoc Mass Spectrom, 20, 1464-1476.

3. Thermo Scienti?c Application Note 10449: Fastscreening, identi?cation, and quanti?cation of pesticideresidues in baby food using GC Orbitrap MS technology.Runcorn, UK.