臨門一腳，先講核心，掌握核心，引物設(shè)計(jì)任你馳騁。

引物長(zhǎng)度

引物長(zhǎng)度對(duì)反應(yīng)特異性、解鏈溫度、退火時(shí)間都有較大的影響，最終影響到 PCR 反應(yīng) 是否成功。多數(shù)情況下，引物長(zhǎng)度約 18~30bp, 引物太短會(huì)導(dǎo)致非特異擴(kuò)增，太長(zhǎng)雖然會(huì)增加特異性，但是二級(jí)結(jié)構(gòu)（如發(fā)夾結(jié)構(gòu)）出現(xiàn)的概率增大。

引物的解鏈溫度

PCR 反應(yīng)的特異性很大程度上依賴于引物的解鏈溫度（Tm 值）。多數(shù) PCR 反應(yīng)的 解鏈溫度應(yīng)在 55~60℃，如果沒有其他不穩(wěn)定因素，引物的 Tm 值取決于它的長(zhǎng)度、序列組成和濃度，離子強(qiáng)度的影響可以忽略不計(jì)，因?yàn)椴煌?PCR 反應(yīng)鹽濃度變化不大。

一個(gè)反應(yīng)中所有引物的解鏈溫度應(yīng)盡可能接近。對(duì)于多數(shù) PCR 反應(yīng)而言，引物之間的 差應(yīng)小于 2~3℃。差值增大，反應(yīng)效率會(huì)降低，甚至直接導(dǎo)致反應(yīng)失敗。因?yàn)?Tm 值髙 的引物在低于退火溫度的條件下錯(cuò)配，而 Tm 值低的引物在髙于退火溫度的條件下與模板只 有低濃度結(jié)合。

可利用以最近鄰熱力學(xué)理論為基礎(chǔ)的公式估算 Tm 值，該理論分析了復(fù)式解鏈的熱力學(xué)過程。

Tm = [△H/△S-RIn(c)]-273.15（公式 1）

復(fù)式構(gòu)成物中焓變（△H）和熵變（△S ）可借助于最近鄰熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算，為摩爾氣 體常數(shù)，c 為寡核苷酸的物質(zhì)的量濃度。該分析可確定特定的焓和熵對(duì)復(fù)式構(gòu)成物的自由能 的影響，該影響由序列中的「最近鄰」造成。最近鄰從 5' 末端起始，焓和熵的效應(yīng)是加性的。在式（1）中加人另一個(gè)條件，以經(jīng)驗(yàn)性地計(jì)算鹽對(duì)復(fù)式構(gòu)成物的穩(wěn)定性的影響。

Tm =[△H/△ S + R In(c)] - 273.15 + 12.0lg[Na+] （公式 2）

大多數(shù)引物設(shè)計(jì)軟件都使用 Breslaner 或 SntaLucia 最近鄰參數(shù)系統(tǒng)估算寡核苷酸復(fù)式構(gòu)成物的 Tm 值（Breslauer et al. 1986; SantaLucia 1998)。

對(duì)于由 20 個(gè)或更少個(gè)堿基組成的短序列，可用 Wallace 原理計(jì)算其位近似值。該 公式假定鹽的濃度為 0.9 mol/L，這是斑點(diǎn)雜交分析的常用濃度。

Tm = 2℃ * (A + T) + 4℃ * (G + C) （公式 3）

一般來說，退火溫度比引物解鏈溫度低 5°C。但是，根據(jù)這一原則得出的退火溫度常常 并不是的，必須通過實(shí)驗(yàn)獲得溫度。利用梯度熱循環(huán)儀很容易實(shí)現(xiàn)這一目的。另外，可利用更精確的公式計(jì)算乃值（退火溫度）（Rychliketal.1990)。

Ta = 0.3 * 引物 Tm 值 + 0.7 * 產(chǎn)物 Tm 值 - 25 （公式 4）

復(fù)制子的解鏈溫度

除了計(jì)算引物的解鏈溫度以外，還要保證產(chǎn)物的解鏈溫度要足夠低，以保證其在 92℃ 時(shí)完全解鏈。一般來說，100~600bp 的片段可以有效擴(kuò)增。該參數(shù)有助于使 PCR 效率更高，但并不總是成功的 PCR 所必需的。產(chǎn)物的 Tm 值可根據(jù)（式 5） 計(jì)算。

Tm = 81. 5 + 16. 6*(lg10[K+])+0.41(%G+C) - 675/長(zhǎng)度 （公式 5）

二級(jí)結(jié)構(gòu)

設(shè)計(jì)引物時(shí)，另一個(gè)需要考慮的重要因素是二級(jí)結(jié)構(gòu)的存在。一個(gè)帶有自身同源序列的引物可以回折形成部分雙鏈的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。類似地，引物之間的同源可能引起引物二聚體的形 成。PCR 反應(yīng)時(shí)，相對(duì)于模板而言，引物濃度髙很多，引物之間相互退火要比引物與模板 之間退火容易得多。因此，引物如果存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)或者二聚體，對(duì)于 PCR 擴(kuò)增往往 是致命的，因?yàn)檫@樣會(huì)導(dǎo)致非特異的大量背景產(chǎn)物的擴(kuò)增。避免出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)的最簡(jiǎn)單的方 法是：選擇 GC 含量約 50%、四種堿基中缺少一種的引物。

重復(fù)

同一堿基或幾個(gè)核苷酸的重復(fù)也應(yīng)盡量避免。不同的重復(fù)對(duì) PCR 反應(yīng)的影響見表 1。

GC 夾

在引物的 3'端包含一個(gè) G 或 C 殘基可增加引物擴(kuò)增效率，這就是所謂的「GC 夾」。它 可以促進(jìn)引物的 3'端正確地結(jié)合到模板，因?yàn)?GC 夾可以形成更為穩(wěn)定的氫鍵，因此可以提髙擴(kuò)增的特異性。以胸腺嘧啶結(jié)尾的引物的特異性有降低的趨勢(shì)。

高 GC 含量片段的擴(kuò)增

為了擴(kuò)增高 GC 含量的 DNA，應(yīng)該設(shè)計(jì) Tm 值（為 75~80℃) 較高的引物。髙 GC 含量的 DNA 雙鏈完全解開所需的溫度明顯較一般的 DNA 高。溫度較低時(shí)，PCR 復(fù)制子的兩條單鏈有較快地重新退火的趨勢(shì)，可與引物退火相互競(jìng)爭(zhēng)。因此，PCR 過程中退火溫度較髙有助于引物退火，因此可以提髙擴(kuò)增效率。

非目標(biāo)同源

應(yīng)利用 BLAST程序?qū)σ镄蛄羞M(jìn)行檢索，查詢是否有競(jìng)爭(zhēng)性序列與其交叉同源或基因組中是否有別的位點(diǎn)與其同源，這種同源序 列將導(dǎo)致引物錯(cuò)配和產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增產(chǎn)物。